近年來，連續制造在生物制藥領域成為最受關注的熱點之一，連續細胞培養技術越來越多應用于動物細胞高密度培養，推動了現代生物醫藥產業的快速發展。

在生物制藥行業中，為將連續培養的優勢充分實現，即細胞培養、收獲和產品純化必須有效的集成，需將包括生物生產和生物過程的平臺包括種子反應器等過程視為一個整體，統籌處理，這是行業內的趨勢。連續細胞培養方式是提高動物細胞密度的有效方式，可以為細胞連續補加新鮮培養液和及時排出代謝產物，提供有利于細胞生長的培養環境。連續培養系統是多元化的，不同動物細胞適應不同的細胞培養反應器和截留裝置，國內外多家企業致力于細胞反應器的研究開發，如美國NBS公司、德國賽多利斯公司、南京百帕斯公司等等。近幾年隨著在線監測裝置，如在線細胞計數儀和生化分析儀等應用優化了連續培養的補料過程，使得連續培養系統在細胞高密度培養應用越來越廣泛。

1    連續細胞培養的優勢

細胞培養的主要能源物質和碳源物質是葡萄糖和谷氨酰胺，這兩者在代謝過程中會產生負代謝產物乳酸和氨。乳酸改變環境的PH和滲透壓，通常灌注葡萄糖來控制乳酸的產生。氨使細胞內UDP氨基己糖積累，進而對細胞生長過程中的蛋白質糖基化過程造成影響，同樣會改變微環境的PH，限制培養基中谷氨酰胺濃度可以緩解氨的產生。同時目標代謝物的積累也會抑制產量提高。所以對于生物反應器細胞培養，為了避免葡萄糖、谷氨酰胺和代謝產物在代謝過程中產生負作用，必須配有高效的灌注系統，一邊把代謝物分離出來，一邊把新鮮營養液成份補充進來。

連續培養有以下優勢：

  • 增加得率：連續培養在連續注入新鮮培養基同時，連續等量排出代謝廢物和目標產物，細胞一直在最適營養環境下生產，維持高密度高活率，大大延遲細胞平臺期目標產物的產量；

  • 保持穩定的培養環境：連續培養把代謝廢物乳酸和氨等負代謝產物排出，營養物充足，細胞在這種穩定適宜的DO、PH、T環境下可以持續分泌產物；

  • 連續培養可以實時監測細胞培養微環境，并調節灌注速率適時提供營養；

  • 可以在更小的設備內生產更多的產品，同時提高產品質量；

  • 尤其是對不穩定、半衰期短的產物，可以及時的分離出來，優勢明顯；

2    連續細胞培養系統

連續細胞培養系統主要有新鮮培養基罐、生物反應器、收獲液罐、控制器、細胞截留裝置和蠕動泵組成。其中生物反應器和細胞截留裝置是核心設備，細胞截留裝置分為罐內分離和罐外分離。灌注系統配置兩臺蠕動泵，新鮮的培養基罐和生物反應器中間連接有蠕動泵Ⅰ，收獲罐和生物反應器間連接有蠕動泵Ⅱ，通過調節蠕動泵Ⅰ保證生物反應器內營養物質充足新鮮，通過調節蠕動泵Ⅱ可以及時的排出生物反應器內代謝產物，同時生物反應器內有液位電極控制反應器內液面穩定，在細胞培養過程中監測葡萄糖濃度、細胞密度以及代謝產物等，及時調整灌注速度保證動物細胞連續高密度培養。

3    生物反應器

生物反應器一直在研究和開發中，動物細胞體外培養對生長基質依賴性可分為貼壁培養和懸浮培養，一類貼壁細胞需要在生物反應器中加入載體輔助細胞快速生長，另一類懸浮細胞，大多數屬于這一類，它們可以像微生物一樣在機械攪拌反應器中懸浮培養生長，但由于動物細胞沒有細胞壁支撐，攪拌槳需要具備低剪切力和良好的傳質傳熱性

灌注培養成功的關鍵是高效的進氣系統，這樣可以為細胞培養提供充足的氧氣。在增強的培養過程中，會形成大量的二氧化碳，必須去除，以防止抑制產物形成的或對產品質量產生的潛在的負面影響。百帕斯生物反應器內，許多微型噴頭構成一個大型噴霧器，通過150微米孔，壓縮空氣并對其進行凈化。

一個不可忽視的問題是，由于高速氣體流量和濃縮細胞培養液中的蛋白質含量，會導致廢氣排放過程中形成過多的氣溶膠。一個專門開發的換熱器原理設計的排氣冷凝器，可以減少堵塞過濾器的風險，并大大提高可靠性。百帕斯生物反應器額外的安全聯鎖控制軟件會防止因堵塞的細胞截留裝置而導致細胞溢出。此外，所有進料泵和氣流如果超過其最大工作壓力，則將會中斷進料。

4    細胞截留裝置

細胞截留裝置有重力沉降、旋轉過濾器、中空纖維膜和離心等幾種系統，各種系統需滿足下列要求：細胞截留裝置效率高且穩定；能夠長期使用；截留裝置必須干凈、無菌，可以重復使用；對培養基和細胞損傷小；

重力沉降裝置有結構簡單、無堵塞、對細胞剪切力小、成本低等優點，但是普遍存在細胞團大量黏附于沉降器底部，導致細胞在在其他負增長空間平均停留時間過長，代謝產物能力和細胞活性下降等問題，最終影響灌注培養效率，這也導致了它不可能用于大規模生產。

旋轉過濾器截留裝置，一般小型反應器旋轉過濾網和攪拌槳葉在同一軸上，大型反應器旋轉過濾網單獨設置，旋過濾網壁面上分布篩孔，一般篩孔大小為20-50μm，具體篩孔大小針對細胞大小選型設計。但是由于長時間高密度細胞灌注培養，細胞很容易聚集結團附著于篩網面上，即旋轉過濾器會出現堵塞問題。

中空纖維膜截留裝置，其實是一種切向流過濾分離系統，細胞液通過泵入中空纖維膜柱內腔，在纖維膜兩側產生跨膜壓，過濾過程由跨膜壓驅動，細胞等大分子被截留下來，流回生物反應器，小分子的代謝產物則透過膜收獲。這種切向流分離有剪切力小、不易堵塞等優點，越來越多的被采用于灌注培養過程中。

連續離心的方式對細胞進行截留的優點是，它避免了過濾器堵塞，并允許死細胞選擇性地分離和去除；缺點是在離心式細胞截留系統中，細胞在反應器之外的滯留時間久，這對細胞的活性有著嚴重的影響。同時，由于離心原理所產生的剪切力也對細胞的活性有著嚴重的損害。

對于所有這些選擇，至關重要的是，保證外部循環盡可能短，以避免細胞培養物暴露于不受控制的環境條件，最關鍵的是那些與溫度、PH和溶解氧有關的因素。

5    連續培養的關鍵點

灌注率下降到每天1-2個反應器體積的范圍，采用較低的細胞濾出速度可以建立恒定的細胞生長速率，并且可以維持高的存活率，進而最大限度避免細胞截留裝置的堵塞。根據細胞截留膜的孔徑大小或截留率，產物將存在于在無細胞上清液（微濾灌注）中或保留在生物反應器中（超濾灌注）。由于大多數抗體或抗原是相對穩定的，所以在生物反應器中直接灌注的策略，為這種產物的積累提供了一種簡單而直接的方法，增加給定抗體制造設施的空間/時間產量。對于易降解或失活的重組蛋白或抗原，微濾灌注是一種較好的選擇。那些可能表現出反饋抑制作用的產物，應盡可能快地從細胞培養中分離出來，然后在隨后的純化過程中轉移到冷卻的收獲罐中。

新興技術應用于細胞培養過程的開發、規模化和過程控制。一旦這些應用與高性能、單用途的生物反應器相結合，那么極高的細胞密度培養就成為了現實。關鍵工藝參數的控制需要先進的過程控制軟件和適當的過程分析程序。氧和二氧化碳傳感器可安裝于生物反應器排氣線路，以監測和提供額外的觀察細胞培養代謝。在連續細胞培養過程中，可以使用營養物質和代謝物如葡萄糖和乳酸的測量值來提供營養供應和培養的一般代謝狀態的信息。這些信息可以幫助公司使用全自動控制回路確定最合適的營養供給率。

自動化可行的生物測量完全可以集成到生物反應器中，以提供獨立的生物觀測信息。線測量減少了手工取樣的必要。通過將這種傳感器安裝在生物反應器控制系統中，使在連續培養過程中自動監測和控制成為可能。

生物反應器和細胞培養技術不斷發展，使細胞密度得到提高和保持。生物制藥公司是否選擇分批補料工藝或開發連續細胞培養方法將取決于它們各自的情況。技術創新將使他們能夠加快臨床試驗的速度，并在預定的設計空間內開發出高滴度的抗體或疫苗。

6    總結

連續連培養作為一種新型技術極大的拓展了人們對工藝生產方式的理解，它解決了因蛋白和抗原質量不穩定或者表達量偏低，以及fed-batch無法保證批次穩定控制等一系列問題，而且去除了中間一些不必要的放大步驟，簡化了生產工藝。從法規層面來看，FDA成立EmergingTechnology Team（應對新型技術團隊）對連續連生產持開放和支持的態度，他們認定連續灌注是一項能帶來穩定和更高效生產的技術。同時，由于其豐富的產品線，國內一些大的生物制藥企業考也開始嘗試從傳統的fed-batch向連續生產轉變，以期解決傳統培養工藝無法真正滿足需求的問題。但與此同時，其特定的培養模式也面臨著一些挑戰，比如如何在長時間的培養中防止染菌，驗證從收獲到純化得到的各“亞批次”之間的一致性等，這些問題在企業快速申請報批時會顯得尤為重要。

上述討論的工藝開發中的關鍵點看似相互分離，但實則牽一發而動全身，實際過程中切不可只考慮到某一因素對結果的影響，而應采用多變量分析的方法充分考慮不同變量之間的關系，以及綜合效應對產物表達和質量的影響。因此，要想實現連續生產還需要投入更多的時間和精力，才能將上游和下游真正的融合為一個整體，實現高質量蛋白或抗原穩定均一的表達和生產。