近年來，連續(xù)制造在生物制藥領(lǐng)域成為最受關(guān)注的熱點(diǎn)之一，連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)越來越多應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞高密度培養(yǎng)，推動(dòng)了現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

在生物制藥行業(yè)中，為將連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)勢充分實(shí)現(xiàn)，即細(xì)胞培養(yǎng)、收獲和產(chǎn)品純化必須有效的集成，需將包括生物生產(chǎn)和生物過程的平臺包括種子反應(yīng)器等過程視為一個(gè)整體，統(tǒng)籌處理，這是行業(yè)內(nèi)的趨勢。連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)方式是提高動(dòng)物細(xì)胞密度的有效方式，可以為細(xì)胞連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液和及時(shí)排出代謝產(chǎn)物，提供有利于細(xì)胞生長的培養(yǎng)環(huán)境。連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)是多元化的，不同動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)不同的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器和截留裝置，國內(nèi)外多家企業(yè)致力于細(xì)胞反應(yīng)器的研究開發(fā)，如美國NBS公司、德國賽多利斯公司、南京百帕斯公司等等。近幾年隨著在線監(jiān)測裝置，如在線細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和生化分析儀等應(yīng)用優(yōu)化了連續(xù)培養(yǎng)的補(bǔ)料過程，使得連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)在細(xì)胞高密度培養(yǎng)應(yīng)用越來越廣泛。

1    連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢

細(xì)胞培養(yǎng)的主要能源物質(zhì)和碳源物質(zhì)是葡萄糖和谷氨酰胺，這兩者在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生負(fù)代謝產(chǎn)物乳酸和氨。乳酸改變環(huán)境的PH和滲透壓，通常灌注葡萄糖來控制乳酸的產(chǎn)生。氨使細(xì)胞內(nèi)UDP氨基己糖積累，進(jìn)而對細(xì)胞生長過程中的蛋白質(zhì)糖基化過程造成影響，同樣會(huì)改變微環(huán)境的PH，限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度可以緩解氨的產(chǎn)生。同時(shí)目標(biāo)代謝物的積累也會(huì)抑制產(chǎn)量提高。所以對于生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)，為了避免葡萄糖、谷氨酰胺和代謝產(chǎn)物在代謝過程中產(chǎn)生負(fù)作用，必須配有高效的灌注系統(tǒng)，一邊把代謝物分離出來，一邊把新鮮營養(yǎng)液成份補(bǔ)充進(jìn)來。

連續(xù)培養(yǎng)有以下優(yōu)勢：

  • 增加得率：連續(xù)培養(yǎng)在連續(xù)注入新鮮培養(yǎng)基同時(shí)，連續(xù)等量排出代謝廢物和目標(biāo)產(chǎn)物，細(xì)胞一直在最適營養(yǎng)環(huán)境下生產(chǎn)，維持高密度高活率，大大延遲細(xì)胞平臺期目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量；

  • 保持穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境：連續(xù)培養(yǎng)把代謝廢物乳酸和氨等負(fù)代謝產(chǎn)物排出，營養(yǎng)物充足，細(xì)胞在這種穩(wěn)定適宜的DO、PH、T環(huán)境下可以持續(xù)分泌產(chǎn)物；

  • 連續(xù)培養(yǎng)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，并調(diào)節(jié)灌注速率適時(shí)提供營養(yǎng)；

  • 可以在更小的設(shè)備內(nèi)生產(chǎn)更多的產(chǎn)品，同時(shí)提高產(chǎn)品質(zhì)量；

  • 尤其是對不穩(wěn)定、半衰期短的產(chǎn)物，可以及時(shí)的分離出來，優(yōu)勢明顯；

2    連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有新鮮培養(yǎng)基罐、生物反應(yīng)器、收獲液罐、控制器、細(xì)胞截留裝置和蠕動(dòng)泵組成。其中生物反應(yīng)器和細(xì)胞截留裝置是核心設(shè)備，細(xì)胞截留裝置分為罐內(nèi)分離和罐外分離。灌注系統(tǒng)配置兩臺蠕動(dòng)泵，新鮮的培養(yǎng)基罐和生物反應(yīng)器中間連接有蠕動(dòng)泵Ⅰ，收獲罐和生物反應(yīng)器間連接有蠕動(dòng)泵Ⅱ，通過調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵Ⅰ保證生物反應(yīng)器內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)充足新鮮，通過調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵Ⅱ可以及時(shí)的排出生物反應(yīng)器內(nèi)代謝產(chǎn)物，同時(shí)生物反應(yīng)器內(nèi)有液位電極控制反應(yīng)器內(nèi)液面穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中監(jiān)測葡萄糖濃度、細(xì)胞密度以及代謝產(chǎn)物等，及時(shí)調(diào)整灌注速度保證動(dòng)物細(xì)胞連續(xù)高密度培養(yǎng)。

3    生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器一直在研究和開發(fā)中，動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)對生長基質(zhì)依賴性可分為貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，一類貼壁細(xì)胞需要在生物反應(yīng)器中加入載體輔助細(xì)胞快速生長，另一類懸浮細(xì)胞，大多數(shù)屬于這一類，它們可以像微生物一樣在機(jī)械攪拌反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)生長，但由于動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁支撐，攪拌槳需要具備低剪切力和良好的傳質(zhì)傳熱性

灌注培養(yǎng)成功的關(guān)鍵是高效的進(jìn)氣系統(tǒng)，這樣可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供充足的氧氣。在增強(qiáng)的培養(yǎng)過程中，會(huì)形成大量的二氧化碳，必須去除，以防止抑制產(chǎn)物形成的或?qū)Ξa(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生的潛在的負(fù)面影響。百帕斯生物反應(yīng)器內(nèi)，許多微型噴頭構(gòu)成一個(gè)大型噴霧器，通過150微米孔，壓縮空氣并對其進(jìn)行凈化。

一個(gè)不可忽視的問題是，由于高速氣體流量和濃縮細(xì)胞培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)含量，會(huì)導(dǎo)致廢氣排放過程中形成過多的氣溶膠。一個(gè)專門開發(fā)的換熱器原理設(shè)計(jì)的排氣冷凝器，可以減少堵塞過濾器的風(fēng)險(xiǎn)，并大大提高可靠性。百帕斯生物反應(yīng)器額外的安全聯(lián)鎖控制軟件會(huì)防止因堵塞的細(xì)胞截留裝置而導(dǎo)致細(xì)胞溢出。此外，所有進(jìn)料泵和氣流如果超過其最大工作壓力，則將會(huì)中斷進(jìn)料。

4    細(xì)胞截留裝置

細(xì)胞截留裝置有重力沉降、旋轉(zhuǎn)過濾器、中空纖維膜和離心等幾種系統(tǒng)，各種系統(tǒng)需滿足下列要求：細(xì)胞截留裝置效率高且穩(wěn)定；能夠長期使用；截留裝置必須干凈、無菌，可以重復(fù)使用；對培養(yǎng)基和細(xì)胞損傷小；

重力沉降裝置有結(jié)構(gòu)簡單、無堵塞、對細(xì)胞剪切力小、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是普遍存在細(xì)胞團(tuán)大量黏附于沉降器底部，導(dǎo)致細(xì)胞在在其他負(fù)增長空間平均停留時(shí)間過長，代謝產(chǎn)物能力和細(xì)胞活性下降等問題，最終影響灌注培養(yǎng)效率，這也導(dǎo)致了它不可能用于大規(guī)模生產(chǎn)。

旋轉(zhuǎn)過濾器截留裝置，一般小型反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)過濾網(wǎng)和攪拌槳葉在同一軸上，大型反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)過濾網(wǎng)單獨(dú)設(shè)置，旋過濾網(wǎng)壁面上分布篩孔，一般篩孔大小為20-50μm，具體篩孔大小針對細(xì)胞大小選型設(shè)計(jì)。但是由于長時(shí)間高密度細(xì)胞灌注培養(yǎng)，細(xì)胞很容易聚集結(jié)團(tuán)附著于篩網(wǎng)面上，即旋轉(zhuǎn)過濾器會(huì)出現(xiàn)堵塞問題。

中空纖維膜截留裝置，其實(shí)是一種切向流過濾分離系統(tǒng)，細(xì)胞液通過泵入中空纖維膜柱內(nèi)腔，在纖維膜兩側(cè)產(chǎn)生跨膜壓，過濾過程由跨膜壓驅(qū)動(dòng)，細(xì)胞等大分子被截留下來，流回生物反應(yīng)器，小分子的代謝產(chǎn)物則透過膜收獲。這種切向流分離有剪切力小、不易堵塞等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的被采用于灌注培養(yǎng)過程中。

連續(xù)離心的方式對細(xì)胞進(jìn)行截留的優(yōu)點(diǎn)是，它避免了過濾器堵塞，并允許死細(xì)胞選擇性地分離和去除；缺點(diǎn)是在離心式細(xì)胞截留系統(tǒng)中，細(xì)胞在反應(yīng)器之外的滯留時(shí)間久，這對細(xì)胞的活性有著嚴(yán)重的影響。同時(shí)，由于離心原理所產(chǎn)生的剪切力也對細(xì)胞的活性有著嚴(yán)重的損害。

對于所有這些選擇，至關(guān)重要的是，保證外部循環(huán)盡可能短，以避免細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于不受控制的環(huán)境條件，最關(guān)鍵的是那些與溫度、PH和溶解氧有關(guān)的因素。

5    連續(xù)培養(yǎng)的關(guān)鍵點(diǎn)

灌注率下降到每天1-2個(gè)反應(yīng)器體積的范圍，采用較低的細(xì)胞濾出速度可以建立恒定的細(xì)胞生長速率，并且可以維持高的存活率，進(jìn)而最大限度避免細(xì)胞截留裝置的堵塞。根據(jù)細(xì)胞截留膜的孔徑大小或截留率，產(chǎn)物將存在于在無細(xì)胞上清液（微濾灌注）中或保留在生物反應(yīng)器中（超濾灌注）。由于大多數(shù)抗體或抗原是相對穩(wěn)定的，所以在生物反應(yīng)器中直接灌注的策略，為這種產(chǎn)物的積累提供了一種簡單而直接的方法，增加給定抗體制造設(shè)施的空間/時(shí)間產(chǎn)量。對于易降解或失活的重組蛋白或抗原，微濾灌注是一種較好的選擇。那些可能表現(xiàn)出反饋抑制作用的產(chǎn)物，應(yīng)盡可能快地從細(xì)胞培養(yǎng)中分離出來，然后在隨后的純化過程中轉(zhuǎn)移到冷卻的收獲罐中。

新興技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)過程的開發(fā)、規(guī)模化和過程控制。一旦這些應(yīng)用與高性能、單用途的生物反應(yīng)器相結(jié)合，那么極高的細(xì)胞密度培養(yǎng)就成為了現(xiàn)實(shí)。關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制需要先進(jìn)的過程控制軟件和適當(dāng)?shù)倪^程分析程序。氧和二氧化碳傳感器可安裝于生物反應(yīng)器排氣線路，以監(jiān)測和提供額外的觀察細(xì)胞培養(yǎng)代謝。在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，可以使用營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物如葡萄糖和乳酸的測量值來提供營養(yǎng)供應(yīng)和培養(yǎng)的一般代謝狀態(tài)的信息。這些信息可以幫助公司使用全自動(dòng)控制回路確定最合適的營養(yǎng)供給率。

自動(dòng)化可行的生物測量完全可以集成到生物反應(yīng)器中，以提供獨(dú)立的生物觀測信息。線測量減少了手工取樣的必要。通過將這種傳感器安裝在生物反應(yīng)器控制系統(tǒng)中，使在連續(xù)培養(yǎng)過程中自動(dòng)監(jiān)測和控制成為可能。

生物反應(yīng)器和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展，使細(xì)胞密度得到提高和保持。生物制藥公司是否選擇分批補(bǔ)料工藝或開發(fā)連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)方法將取決于它們各自的情況。技術(shù)創(chuàng)新將使他們能夠加快臨床試驗(yàn)的速度，并在預(yù)定的設(shè)計(jì)空間內(nèi)開發(fā)出高滴度的抗體或疫苗。

6    總結(jié)

連續(xù)連培養(yǎng)作為一種新型技術(shù)極大的拓展了人們對工藝生產(chǎn)方式的理解，它解決了因蛋白和抗原質(zhì)量不穩(wěn)定或者表達(dá)量偏低，以及fed-batch無法保證批次穩(wěn)定控制等一系列問題，而且去除了中間一些不必要的放大步驟，簡化了生產(chǎn)工藝。從法規(guī)層面來看，FDA成立EmergingTechnology Team（應(yīng)對新型技術(shù)團(tuán)隊(duì)）對連續(xù)連生產(chǎn)持開放和支持的態(tài)度，他們認(rèn)定連續(xù)灌注是一項(xiàng)能帶來穩(wěn)定和更高效生產(chǎn)的技術(shù)。同時(shí)，由于其豐富的產(chǎn)品線，國內(nèi)一些大的生物制藥企業(yè)考也開始嘗試從傳統(tǒng)的fed-batch向連續(xù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)變，以期解決傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝無法真正滿足需求的問題。但與此同時(shí)，其特定的培養(yǎng)模式也面臨著一些挑戰(zhàn)，比如如何在長時(shí)間的培養(yǎng)中防止染菌，驗(yàn)證從收獲到純化得到的各“亞批次”之間的一致性等，這些問題在企業(yè)快速申請報(bào)批時(shí)會(huì)顯得尤為重要。

上述討論的工藝開發(fā)中的關(guān)鍵點(diǎn)看似相互分離，但實(shí)則牽一發(fā)而動(dòng)全身，實(shí)際過程中切不可只考慮到某一因素對結(jié)果的影響，而應(yīng)采用多變量分析的方法充分考慮不同變量之間的關(guān)系，以及綜合效應(yīng)對產(chǎn)物表達(dá)和質(zhì)量的影響。因此，要想實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)還需要投入更多的時(shí)間和精力，才能將上游和下游真正的融合為一個(gè)整體，實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量蛋白或抗原穩(wěn)定均一的表達(dá)和生產(chǎn)。